پایان نامه زراعت

مقدمه :

کشت بافت گیاهی بطور خلاصه شامل کشت پروتوپلاست ,سلول,بافت و اندام گیاهی است. در همه این کشتها, رشد ماده گیاهی عاری از میکروب در یک محیط سترون مثل محیط کشت مغذی سترون در یک لوله آزمایش صورت می گیرد.در سال های اخیر, تکنیک های کشت بافت گیاهی به یک ابزار خیلی قوی برای تکثیر و اصلاح گونه های گیاهی زیادی تبدیل شده اند. این تکنولوژی با پژوهش گتلیب هابرلنت(Gottlieb Haberlandt) در مورد پر توانی سلول در اوایل قرن 20 شروع شد.وی با توجه به این نکته که با دستکاری محیط کشت سلولها , سلولهای کشت شده مراحل نموی یک رشد عادی را تکرار خواهند نمود , پیشنهاد گسترش تکنیک های جداسازی و کشت بافت های گیاهی را ارائه داد.

کشت اکسین ها توسط ونت Wentو همکاران و کشف سیتوکنین ها توسط اسکوگSkoog  و همکاران, قبل از اولین کشت موفق بافت های گیاهی در آزمایشگاه صورت گرفت (گاتریت,1934 : نوبکورت , 1939).

اولین کشت موفق کالوس هویج و توتون توسط وایتWhite(1943)گزارش گردید. اسکوگ و میلر Miler(1957)گزارش کردند که اثر متقابل کمی بین اکسین ها و سیتوکنین ها نوع رشد و ریخت زایی گیاه را تعیین میکند. مطالعات آنها بر روی توتون نشان داد که نسبت بالای اکسین به سیتوکنین, ریشه زایی را تحریک نموده و پایین بودن این نسبت, باعث تحریک تشکیل اندام هوایی می شود اما این پاسخ, عمومی نیست. با این که دستکاری نسبت اکسین و سیتوکنین در ریخت زایی گونه های زیادی موفقیت آمیز بوده است, اما امروزه واضح است که عوامل زیاد دیگری بر توانایی سلولها در کشت برای تمایز ریشه, اندام هوایی و یا رویان موثر هستند.

ایجاد انگیزه برای بکارگیری تکنیک های کشت بافت گیاهی در تکثیر و اصلاح گونه های گیاهی از کار اولیه مورلMorel(1960) روی تکثیر ارکیده در محیط کشت و تهیه یک محیط کشت جدید با غلظت بالایی از نمک های معدنی توسط موراشیکMurashige و اسکوت(1962)ناشی شد. از آن به بعد, این تکنولوژی به صورت قابل توجهی رشد یافت و امروزه یک نقش کلیدی در تکثیر, اصلاح و مهندسی ژنتیک گیاهی ایفا می کند.

کشت بافت های گیاهی بر پایه سه قابلیت گیاهی استوار است :

1- پر توانی Totipotency, که توان یا ظرفیت توارثی یک سلول گیاهی برای نمو به یک گیاه کامل با القای تحریک مناسب است . پر توانی بر این مطلب دلالت می کند که هر سلول واجد تمام اطلاعات لازم برای رشد و تکثیر می باشد. گرچه از لحاظ نظری همه سلولهای گیاهی پر توان هستند, با این حال سلولهای مریستمی بیشترین توان بیان این ویژگی را دارند .

2- تمایز زداییDedifferentiation , که توان سلولهای بالغ برای بازگشت به شرایط مریستمی است و بعد از آن سلولها با باز تمایزیRedifferentiation  اندام های جدیدی را سازماندهی می کنند .

3- شایستگی Competency , که توانایی ذاتی یک سلول یا بافت گیاهی را برای نمو در یک مسیر مشخص بیان می کند. برای مثال , سلول های با شایستگی رویانی توانایی تبدیل شدن به رویان های کاملا فعال را دارند. در مقابل این اصطلاح , واژه ناشا یستگی یا ناتوانی ریخت زایی بیان می شود.

انواع کشت درون شیشه ای :

1- کشت گیاهان کامل ( برای مثال: کشت بذر ارکیده , کشت دانه رست Seedling)

2- کشت رویان (برای مثال : کشت رویان نارس )

3- کشت اندام ( برای مثال : کشت مریستم )

 کشت شاخساره Shoot tip

کشت ریشه

کشت برگ

کشت بساک

4- کشت کالوس

5- کشت معلق و کشت سلولهای منفرد

6- کشت پروتوپلاست

کاربردهای کشت بافت گیاهی :

عمومی ترین دلایل بکارگیری تکنیک های  درون شیشه ای برای تولید گیاه در جدول -2 خلاصه شده است اما مهم ترین کاربرد آن در این قرن,استفاده از تکنولوژی ژن برای بهبود محصولات است. اهمیت گیاهان برای بشر بر کسی پوشیده نیست. ما به گیاهان برای غذا, فیبر, سوخت, دارو و مسکن وابسته ایم .

بنابراین, جای تعجب نیست که بیشتر فعالیت بشر در جهت افزایش و تولید گیاهی با خصوصیات  مفید متمرکز می شود.

روش های مرسوم برای اصلاح گیاهان زیاد بررسی شده اند. اما این روش ها محدودیت هایی دارند. پیشرفت قابل توجه در دانش ما از مکانیسم های ملکولی و سلولی که فعالیت ها و اعمال سیستم های زنده را پشتیبانی می کنند ما قادر به توسعه روش های جدید در بهبود گیاهان نموده است.  این تکنیک ها بر روی کاربرد زیست شناسی ملکولی و سلولی تاکید می کنند. سهم بیوتکنولوژی گیاهی از طریق دست ورزی ژن فقط محدود به افزایش عملکرد محصولات یا تولید وسایلی برای پیشگیری از آسیب آفات و امراض نمی شود , بلکه ما را در افزایش کیفیت غذا و روش استفاده از زمین یاری می دهد . بنابراین , بیوتکنولوژی گیاهی توانایی قابل توجهی برای رشد و افزایش کیفیت زندگی و سلامتی بیوسفر دارد.

جدول 1-2- کاربردهای کشت بافت گیاهی :

 تکثیر کلونی سریع و در مقیاس وسیع گیاهان یکسان از یک منبع گیاهی برتر

حذف عوامل بیماری زا , همچنین تسهیل انتقال ماده گیاهی از راه مرزهای بین المللی.

تهیه منابع عاری از بیماری به صورت کشت درون شیشه ای .

ذخیره ژرم  پلاسم و ذخیره بلند مدت منابع گیاهی.

گزینش جهش یافته ها از جهش های خود بخودی یا القایی.

تولید ریز قلمه های ریشه دار شده در گونه های زینتی چوبی سر سخت.

باز یابی دو رگها از گونه های ناسازگار توسط کشت رویان یا تخمک.

تولید گیاهان هاپلوئید از راه کشت بساک. گیاهان هاپلوئید ممکن است برای بازیابی جهش های مغلوب در برنامه های اصلاحی استفاده شوند. باز زایی متوالی, باعث تولید هاپلوئیدهای مضاعف شده هموزیگوس شده و بنابراین لاین های اصلاحی خالص فراهم می شوند.

روش های سترون سازی :

اهمیت موضوع رعایت شرایط استریل در طی انجام کشت بافت های گیاهی به قدری واضح است که تاکید بر آن توضیح واضحات است.

با رعایت چند مورد احتیاطی ساده می توان ضمن جلوگیری از آلودگی میکروبی محیط از هدر رفتن اوقات پر ارزش مصرف شده در آزمایشگاه به منظور تکرار کشت های آلوده شده ممانعت به عمل آورد.

در انتخاب محل اتاق کار سترون مهم ترین موضوع منحصر به فردی که باید دقیقا مورد توجه قرار گرفته شده باشد جلوگیری از جریان یافتن هوای معمولی بر روی محل کار استریل شده می باشد , زیرا جریان هوا با انتقال دادن اسپورها و ارگانیسم های آلوده کننده به اتاق کار سبب ایجاد آلودگی در کشتها می شود. اختصاص دادن یک اتاق کوچک اندرونی, اتاقی شبیه تاریکخانه عکاسی, به عنوان اتاق کار سترون شده روش بسیار مطلوبی است.

در این قبیل اتاقکها معمولا به منظور انهدام اجرام میکروبی موجود در هوا و سترون کردن سطوح داخلی اتاقک لامپ میکروب کش تولید کننده اشعه ماورا بنفش نصب می شود. اشعه این لامپ ها (که طول موج آن 253.7 نانومتر است) اجرام میکروبی را به آهستگی منهدم می کند, ولی بدلیل عدم نفوذ تشعشعات این لامپ ها به قسمت های عمقی و قسمت های گرد گرفته و سایه گیر اتاقک کار اجرام میکروبی این قسمتها از گزند این اشعه مصون می مانند. بهمین دلیل اگر چه استعمال این لامپ در اتاقک های کار کاملا مرسوم است, ولی تاثیر قطعی آن در ایجاد محیط کاملا عاری از میکروب مورد شک و تردید می باشد (18, و 11). عمر لامپ های ما وراء بنفش نسبتا کوتاه است . البته پس از متوقف شدن تولی اشعه ما وراء بنفش در طول موج 253.7 نانومتر این لامپ ها برای مدتی به تولید نور مرئی ادامه می دهند. در صورت وجود ابزار پلاستیکی در اتاقک کار از روشن کردن لامپ اشعه ما وراء بنفش خودداری نمود. ضمنا ادعا شده است که این لامپ ها ممکن است باعث تولید شدن مواد بازدارنده رشد در مدیوم کشت شوند. خلاصه اینکه استفاده از این گونه لامپ های میکروب کش باید بحداقل ممکن کاهش داده شده و نباید بسهولت جایگزین سایر روشهای سترون سازی شوند. کابینت های رومیزی مجهز به جریان هوای سترون شده بنحوی طراحی شده اند که در آنها جریان ملایمی از هوای الترافیلتره و سترون شده بطور مداوم از روی میز کار عبور داده می شود تا میزان تماس هوای معمولی آلوده به اجرام میکروبی با مواد و ابزار کشت بحداقل مقدار ممکن کاهش داده شود. به هنگام روشن کردن چراغ الکلی در داخل این قبیل کابینت ها باید موارد احتیاط رعایت شوند, زیرا که الکل به شدت آتش گیر است و جریان هوای داخل کابینت ممکن است شعله های آتش را به سمت محقق هدایت کند. ضمنا در حین انجام کشت پس از فرو برده شدن ابزار کار به داخل شیشه محتوی الکل اتانول یا الکل ایزوپروپانول 80 درجه ابتدا باید با استفاده از کاغذ صافی استریل الکل اضافی آنها گرفته شده و سپس آنها برروی شعله چراغ الکلی گرفته شوند. قبل از شروع عملیات سترون نیاز میز کار باید با حوله کاغذی آغشته به الکل اتانول و یا الکل ایزوپروپانول 80 درجه ضدعفونی شود. یکی دیگر از مسائل مبتلا به فعالیت های سترون نیاز و عمده ترین منبع آلودگی کشتها کثیف بودن دستهای محقق است. برای انجام دادن عملیات سترون نیاز شستشوی معمولی دستها با آب کافی نیست , بلکه ضروری است دستها تا آرنج بشدت و به مدت چندین دقیقه با آب گرم فراوان و صابون شستشو داده شوند. دستها را پس از شستشو و خشک کردن باید با محلول خیلی رقیق الکل اتانول یا الکل ایزوپروپانول ضدعفونی نمود.

به منظور سترون سازی ظروف شیشه ای مورد مصرف, ابزار کار, محلولهای غذایی, و مواد گیاهی می توان از روشهای متعددی مانند: حرارت خشک, حرارت مرطوب (بخار داغ), الترافیلتراسیون, و سترون سازی شیمیایی استفاده نمود.

روش حرارت خشک (آون) Dry heat     :

این روش برای ضدعفونی کردن ظروف شیشه ای, ابزار فلزی, و سایر وسایل و موادی که در حرارت های بالا خراب نمی شوند(نمی سوزند) استفاده می شود. البته وسایلی را که در ساختمان آنها پنبه, کاغذ, و یا پلاستیک بکار رفته باشد نمیتوان با حرارت خشک ضدعفونی نمود. تیغ و چاقوهای جراحی و اسکالپل ها نیز نباید با این روش استریلیزه شوند, زیرا حرارت های بالا موجب کند شدن لبه برنده این وسایل میشود. اگرچه در ضدعفونی کردن وسایل با حرارت توصیه میشود که از آون های آزمایشگاهی استفاده شود,ولی می توان از کوره (فر) اجاق گاز و یا اجاق برقی خانگی نیز بهمین منظور استفاده نمود.

استریلیزاسیون با آون شامل سه مرحله مهم می باشد :

مرحله اول شامل زمان لازم برای گرم شدن کوره می باشد. برای گرم شدن کوره و رسیدن دمای محتویات آن به دمای استریلیزاسیون در همه قسمت ها مدت تقریبا یکساعت مورد نیاز است.

مرحله دوم عبارت است از زمان لازم برای استریلیزاسیون. زمان لازم برای استریلیزاسیون بر حسب دمای کوره متغیر است و عبارت است از 45 دقیقه در 160 درجه سانتیگراد, 18 دقیقه در 170 درجه  سانتیگراد, 5/7 دقیقه در 180 درجه  سانتیگراد, و 5/1 دقیقه در 190 درجه  سانتیگراد .اگر دمای کوره حرارتی در یک درجه متعادل مثلا در 160 درجه سانتیگراد تنظیم شده باشد زمان لازم برای اجرای استریلیزاسیون (مجموع سه مرحله) تقریبا دو ساعت خواهد بود .

مرحله سوم عبارت است از زمان لازم برای خنک شدن کوره می باشد.

 توصیه می شود که بمنظور جلوگیری از ترک برداشتن ظروف شیشه ای, در اثر کاهش ناگهانی درجه حرارت, پس از اتمام استریلیزاسیون و قبل از بیرون آوردن ظروف از داخل کوره مدتی هم برای خنک شدن آنها اختصاص داده شود. قبل از قرار داده شدن وسایلی که قرار است در کوره حرارتی استریلیزه شوند باید آنها به دقت با ورق آلومینیومی مقاوم پیچیده شوند. در کشور امریکا سه نوع ورق آلومینیومی بصورت تجاری عرضه می شوند که عبارتند از : ورق آلومینیومی نازک, مقاوم, و خیلی مقاوم. در تحقیقات مربوط به کشت بافت های گیاهی همیشه از نوع مقاوم استفاده میشود, زیرا در نوع نازک اکثرا سوراخهای بسیار ریزی وجود دارد و نوع خیلی مقاوم نیز برای پیچیدن شیشه آلات بیش از حد ضخیم است. پس از اتمام عمل سترون سازی ابزار استریلیزه شده, که هنوز در ورق آلومینیومی پیچیده هستند, به اتاقک کار منتقل میشوند.

روش حرارت مرطوب ( بخار داغ ) Wet Heat     :

در این روش از اتوکلاوهایی که قادر به تولید بخار داغ تحت فشار هستند استفاده میشود . اگر در آزمایشگاه اتوکلاو وجود نداشته باشد میتوان بجای آن از یک دیگ بخار و یا دیگ زود پز تحت فشار استفاده نمود. بمنظور استریلیزه کردن مواد کاغذی, ظروف شیشه ای, سایر ابزار کار, و ارلن های محتوی مایع (بشرطی که در هر ظرف شیشه ای کمتر از 50 سانتیمتر مکعب مایع وجود داشته باشد) فشار بخاری معادل 15 پوند بر اینچ مربع (4/103) در دمای 121 درجه سانتیگراد بمدت 15 دقیقه مورد نیاز میباشد.  اگر در آزمایشگاه اتوکلاو وجود نداشته باشد میتوان بجای آن از یک دیگ بخار و یا دیگ زود پز تحت فشار استفاده نمود. بمنظور استریلیزه کردن مواد کاغذی, ظروف شیشه ای, سایر ابزار کار, و ارلن های محتوی مایع (بشرطی که در هر ظرف شیشه ای کمتر از 50 سانتیمتر مکعب مایع وجود داشته باشد) فشار بخاری معادل 15 پوند بر اینچ مربع (4/103) در دمای 121 درجه سانتیگراد بمدت 15 دقیقه مورد نیاز میباشد.  با افزایش حجم مایعات موجود در ظروف شیشه ای حداقل زمان لازم برای استریلیزاسیون نیز افزایش می یابد.

زمان شروع استریلیزاسیون باید از لحظه ای حساب شود که دمای اتوکلاو و یا دیگ زود پز تحت فشار به دمای تعیین شده رسیده و تمامی هوای موجود در اتوکلاو و یا دیگ زود پز نیز بیرون رفته و جای آنرا بخار داغ پر کرده باشد. اگر از زود پز تحت فشار استفاده میشود تا زمانی که بخار خالص و مداوم از آن خارج نمی شود نباید دریچه تخلیه بخار را مسدود نمود. در خاتمه زمان استریلیزاسیون ,فشار داخل اتوکلاو باید بتدریج کاهش داده شده و به حد فشار معمولی رسانده شود, زیرا کاهش سریع و ناگهانی فشار به بیرون ریخته شدن مایعات جوشان موجود در داخل ظروف شیشه ای منجر خواهد شد. باید از طولانی تر شدن بیش از حد زمان استریلیزاسیون اجتناب شود, زیرا این عمل ممکن است باعث تجزیه شدن مواد شیمیایی موجود در مدیوم گردد .

پس از اتوکلاو کردن هر گونه جسم کاغذی, جسم مزبور باید به مدت کوتاهی در کوره خشک با حرارت کمتر از 60 درجه سانتیگراد قرار داده شود تا اینکه رطوبت باقی مانده آن تبخیر شود. در طول استریلیزاسیون بخار داغ باید بتواند بداخل مواد نفوذ نماید , زیرا دمای121 درجه سانتیگراد فی نفسه قادر به سترون سازی کامل مواد نیست.

(جداول در فایل اصلی قابل مشاهده است)