روش تحقیق عوامل بیماری زای قارچی و باکتریایی زیتون

چکیده

عوامل بیماری زای قارچی و باکتریایی از مهمترین عوامل کاهش تولید زیتون در دنیا محسوب می گردد. با توجه به اهمیت این محصول، در راستای اجرای برنامه های توسعه کشت زیتون، مطالعات و تحقیقات همه جانبه‌ای در استان های کشور انجام شده است.

باغات زیتون کشور و نیز باغات مادری زیتون درشهرستان طارم علیا واقع در استان زنجان که کانون تولید قلمه و نهال زیتون در کشور است، از لحاظ عوامل بیماری زایی و تعیین پراکنش هر یک از بیماری ها بررسی شده اند.

باغات مورد بررسی به طور تصادفی انتخاب شده و پس از بررسی درختان موجود در هر باغ، از علائم مشکوک و آلوده به بیماری نمونه برداری و به منظور جداسازی عوامل بیماریزا به آزمایشگاه منتقل شده اند. به روش های معمول آزمایشگاهی و روش های توصیه شده برای هر عامل نسبت به جداسازی ، خالص سازی و اثبات بیماری زایی عوامل قارچی اقدام گردیده و نمونه های مشکوک به عوامل باکتریایی و ویروسی در مؤسسات تحقیقات آفات و بیماری های گیاهی مورد بررسی قرار گرفته اند. در هر باغ و کل منطقه براساس تعداد درختان بازدید شده و بیمار و تعداد باغات بررسی شده، میزان آلودگی و پراکنش آن ها برآورد گردیده است.

در باغات جدیدالاحداث نیز همه قارچ های فوق الذکر از ریشه و طوقه نهال های جوان بیمار جداسازی گردیده است که با توجه به اینکه در باغات جدید الاحداث در اراضی بایر احداث می گردند و تقریباً عاری از عوامل مزبور می باشند، به احتمال زیاد این عوامل توسط نهال های آلوده به باغات جدید منتقل شده اند. درباغات کهنسال قارچ های Armillaria mellea, Roselinia necatrix از ریشه درختان در حال زوال جداسازی گردید.

در باغات مسن قارچ‌های بیماری‌زای هوازاد نیز مورد شناسایی قرار گرفتند که مهمترین آن ها عبارت بودند از Spilocea oleaginum عامل بیماری لکه طاوسی، Hormiscium oleae عامل خشکیدگی نوک سرشاخه ها و گونه های Alternaria  عوامل لکه برگی.

در سال 78 برای کنترل عوامل بیماری زای عامل خشکیدگی قلمه ها و نهال ها اقدام به ضدعفونی خاک مورد استفاده نهالستان ها با متیل بروماید گردید. نتیجه این عمل در کاهش عوامل مزبور بالاخص Verticillium dahliae بسیار رضایتبخش بود.

مقدمه

درخت زیتون با نام علمی Olea europea گیاهی است همیشه سبز و بومی نواحی گرمسیر که در صورت وجود 300 میلی متر بارندگی سالیانه کشت دیم آن نیز امکان پذیر می‌باشد. براساس محاسبات به عمل آمده در سازمان جهاد کشاورزی زنجان امکان توسعه کشت زیتون تا سطح 20 هزار هکتار قابل دستیابی بوده و می تواند سالیانه حدود 16000 تن روغن زیتون در منطقه تولید نماید که با محاسبات قیمت روغن زیتون در بازارهای جهانی ( هر تن معادل 800 دلار) ارزش اقتصادی آن سالانه 8/12 میلیون دلار می‌باشد که می‌تواند تحول عظیمی از نظر اقتصادی و اجتماعی ایجاد نماید.

زیتون در ایران در نواحی طارم، گرگان، مازندران، گیلان، خوزستان، فارس، خوربیانک، رامیان، کوهستان‌های دالاهو، لرستان، کهکیلویه و بویراحمد، چهار محال و بختیاری، کرمان، قزوین، کردستان و گرمسار کشت می گردد.

در جهان به دلیل اهمیت زیتون و فرآورده های آن درصنایع مختلف، تحقیقات زیادی درباره کشت و پرورش، آفات و بیماری های گیاهی و ارقام مختلف آن و روش های کنترل آفات و بیماری های این درخت در دنیا صورت گرفته است. در تحقیقات گیاهپزشکی، عوامل بیماری زای متعددی از روی درختان زیتون جدا و گزارش شده است و اهمیت هر یک از آن ها از نظر کمی و کیفی روی محصول مورد توجه قرار گرفته است.

لکه برگی ها، بیماری‌های آوندی، بیماری های ریشه و طوقه و رشد قارچ‌های بیماری زا روی میوه زیتون که در انبار باعث افزایش اسیدیته روغن می‌شود از جمله عوامل مهمی است که موجب خسارت در تولید این محصول می گردد.

مهمترین بیماری های درخت زیتون، پژمردگی ورتیسیلیومی، لکه چشم طاووسی، مومی شدن میوه، کپک دوده ای و ماکروفوما، تعیین و تشخیص شده است.

بیماری پژمردگی ورتیسیلیومی در تمامی کشورهای شمالی مدیترانه، سوریه و کالیفرنیا وجود دارد که باعث کم شدن عملکرد، خشک شدن شاخه های جوان وخشکیدن کامل درخت می‌شود.

این بیماری را در جنوب سوریه عمده مشکلات پرورش درختان زیتون عنوان می‌نمایند و بررسی های انجام شده در باغات 10-5 ساله نشان می دهد که آلودگی به این بیماری تا 29/49 درصد باغات وجود داشته و در جایی که در سال های قبل از احداث باغ سبزیجات مانند گوجه فرنگی کشت می شده است این بیماری شیوع بیشتری داشته است.

بیماری های مهم درختان زیتون درکشورهای مدیترانه ای عبارتند از گال باکتری با عامل Pseudomonas syringae، لکه چشم طاووسی با عامل (Spiloceae oleagina) با گسترش زیاد و قابل توجه و شدت بالا در کلیه مناطق کشت زیتون، پژمردگی  وریتسیلیومی با عامل Verticillium dahliae  و آنتراکنوز زیتون با عامل Glomerella cingulata با توسعه و گسترش محدود وکم ولی شدت بالا در درختان آلوده و دیگر بیماری میوه با عامل Mycocentrospora cladosprioides و Camarosporium dalmatica و نکروز باعامل Phoma incompta و دیگر بیماری ها که از قارچ های کم اهمیت می باشند.

در ایتالیا بیماری هایی که روی اپیدمیولوژی و روش های کنترل آن ها به منظور اجرای یک برنامه تلفیقی در جهت کنترل بیماری و کاهش دفعات مبارزات شیمیایی تحقیقاتی صورت گرفته است، عبارتند از پوسیدگی های ریشه، لکه برگی ها باگال باکتریایی و خسارت نماتدهای گیاهی و خشکیدن درختان.

بیماری که چشم طاووسی با گستردگی زیاد در مناطق مدیترانه‌ای به عنوان مهمترین عامل کاهش محصول و بیماری گال باکتریایی با آلودگی شدید در یونان گزارش شده است.

در سال 1994 در ایتالیا قارچ Phoma incompta را به عنوان عامل جدید بیماری که موجب تغییر رنگ آوندهای چوبی، قهوه ای شدن برگ ها و خشکیدگی شاخه‌های جوان می‌شود معرفی نمودند.

علائمی از سکته ، بد شکلی و داسی شدن برگ و زردی از علائم بیماری های ویروسی بر روی درختان زیتون می باشد، ضمن اینکه تلاش برای تشخیص ایزوله های عامل بیماری ناموفق بوده است با عمل پیوند نیز به طور رضایت بخش نتوانسته اند علائم را انتقال دهند. درسال 1976 در ایتالیا یک ایزوله ویروس از درخت زیتون جدا گردید که هیچ علائمی روی آن نداشته است، این ویروس استرینی از SLRV بوده که روی درختان گیلاس و زردآلو نیز دیده می‌شود و در قسمت مرکزی ایتالیا تنها در یک مورد روی درختان بد شکلی برگ و میوه ایجاد نموده است. بعدها نیز تعدادی ویروس از درختان زیتون جدا شده است که بدون علائم بوده اند.

در سال 1343، اسکندری از نواحی شمالی ایران ، بیماری لکه طاووسی را جمع آوری و قارچ های Harmiscium olea, Spiloceae نیز توسط ارشاد در سال های 1356 از درختان زیتون گزارش گردید.

براساس طرح های تحقیقاتی و نمونه برداری ها و مطالعات موردی در منطقه طارم و شمال کشور از قسمت های ریشه و برگ زیتون قارچ های Fusarium oxysporum ، Armillariella mellea، Verticillium dahliae، V.alboatrum، Marssonia olivarum ، Phoma sp، Botrytis cinerae ، Nigrospora sp و Spiloceae oleagina جدا گردیده است.

پوسیدگی ریشه ناشی از Fusarium solani در قلمستان ها و Rhizoctonia sp و Pythium sp، Macrophoma phaseolina توسط افشاری آزاد و همکاران در سال 1377 از درختان زیتون گزارش شده است.

صارمی در سال 1379 قارچ های Fusarium solani را علت مرگ نهال های اولیه زیتون و Verticillium dahliae را عامل Opoplexy و مرگ سریع نهال های جوان و شاخه های درختان مسن و Cycloconium oleaginum را عامل لکه چشم طاووسی برگ زیتون و قارچ Phoma sp را عامل لکه گرد و کوچک مدور در سطح برگ ها را در مناطق طارم زنجان، رودبار، گرگان، مشهد، و اطراف قم گزارش نموده است.

از زمان شروع اجرای طرح توسعه باغات زیتون تاکنون، عارضه خشکیدگی نهال ها در مبادی تولید و درختان جوان در باغات جدید الاحداث خسارات سنگینی به تولید کنندگان نهال و باغداران کشور وارد ساخته است. عوامل بیماری زای دخیل در ایجاد این عارضه از سال 1376 تاکنون در نقاط مختلف کشور جداسازی، شناسایی و گزارش گردیده است.

نظر به اینکه احتمال می رفت بخشی از آلودگی ها ناشی از تهیه قلمه از درختان مادری آلوده باشد، لذا درختان زیتون باغات منتخب برای قلمه گیری از نظر آلودگی به عوامل بیماری زا به ویژه بیماری آوندی مورد بررسی قرار گرفتند. برای این منظور درختان مادری زیتون در هر منطقه قبل از شروع فصل قلمه گیری ( نیمه دوم شهریور و نیمه دوم اسفند) مورد بررسی و بازدید قرار گرفتند و پس از ثبت تعداد درختان وارقام موجود در هر باغ، از درختانی که دارای علائم پژمردگی یا خشکیدگی بودند نمونه برداری و به آزمایشگاه منتقل گردیدند. نمونه ها پس از ضدعفونی سطحی در محیط کشت های PDA، CMA و زاپک – الکل مورد کشت قرار گرفته و در دمای 25 درجه سانتی گراد به مدت 7-3 روز نگه داری گردیدند. پس از ظهور کلنی قارچ ها و خالص سازی آن ها اقدام به مطالعه میکروسکوپی و شناسایی گردید. نتایج بررسی ها در استان گلستان نشان داد که مهمترین بیماری‌های شایع در درختان مادری زیتون این استان ، پژمردگی وریتسلیومی با عامل Verticillcum dahliae و لکه چشم طاووسی با عامل Cycloconium oleaginum می‌باشد. پژمردگی وریتسلیومی در تمام باغات منتخب استان گلستان وجود داشت. متوسط آلودگی به V.dahliae در باغ مدیریت کشاورزی کردکوی 2/3% و C.oleaginum 6/38% برآورد گردید. در بین 13 رقم موجود در باغ مزبور، بیشترین آلودگی به ورتیسلیوم در ارقام کنسروالیا (14%)، سویلانا(10%) و ماری (9%) مشاهده گردید. در ارقام کروناکی، مانزانیلا، والانولیا و کالامون آلودگی مشاهده نشد. آلودگی به سیکلوکونیوم نیز تقریباً در تمام ارقام مشاهده می شد. ارقام زرد (95%)، آمیگدالولیا (85%)، سویلانا (75%) بیشترین آلودگی را داشتند، در حالیکه ارقام کروناکی، بلدی و والانولیا کمترین آلودگی را نشان می‌دادند. در استان زنجان 1/12% درختان باغات منتخب زیتون دارای علائم سرخشکیدگی شاخه ها، 7/12% درختان دارای علائم لکه چشم طاووسی، 6/5% درختان دارای پوسیدگی ریشه و طوقه ناشی از Armillariella mellea  و 5/1% درختان دارای علائم پژمردگی وریتسلیومی بودند و از آن ها V.dahliae جداسازی و بیماری زایی آن ها به اثبات رسید. در استان گیلان (حومه رودبار، منجیل، لوشان و رستم آباد) از بین عوامل بیماری زا C.oleaginum عامل لکه چشم طاووسی و Botrytis cinerea عامل سرخشکیدگی شاخه ها از فراوانی بیشتری برخوردار بودند. قارچ V.dahliae تنها از تعداد معدودی از درختان جداسازی گردید.

به منظور بررسی فعالیت نماتدهای پارازیت گیاهی از خاک گلدان های حاوی قلمه و نهال های زیتون، آن هایی که پژمرده یا خشک شده اند را به روش استفاده الک و سانتریفوژ جداسازی و بعد از بررسی عدم وجود و یا وجود نماتدهای پارازیت گیاهی در نمونه ها مشخص می گردد که این عمل در استان گیلان انجام شده و نماتد شناسایی شده و تحقیقاتی روی آن ها صورت گرفته است.

در آخر لازم به ذکر است که زیتون گیاهی است مقاوم به کم آبی و سازگار با خاک های کم مایه و به تعبیری محصول ثروتمند خاک های فقیر است ، این گیاه بومی آسیای غربی( ایران، اردن، عراق) بوده و در ایران تا قبل از اجرای طرح توسعه، زیتون منحصراً‌ در شیب های تند، سنگلاخ و کم آب دره سفید رود، رودبار، منجیل و طارم با سطح زیر کشت 6500 هکتار کشت می شد و در مناطق دیگر مثل گرگان و مازندران به دلیل عدم توجه، درختان زیتون از بین رفته و تنها نشانه هایی از آن به جا مانده است.

روش تحقیق و بررسی:

1- بازدید و نمونه برداری: در طول سال های 76و77و78 توسط مجریان تحقیق، به طور مستمر از باغات و نهالستان های کشور بازدید به عمل آمد و به منظور ارزیابی و تعیین وضعیت آلودگی درختان مادری زیتون، چندین باغ مادری به طور پراکنده انتخاب شده و مشخصات هر باغ، محل جغرافیایی ، مساحت، روش و دور آبیاری، ارقام درختان، تعداد درختان و علائم مشاهده شده ثبت گردید. با توجه به مساحت باغ و تعداد درختان موجود در آن، تعدادی از درختان به طور تصادفی مورد بررسی قرار گرفت و علائم غیرطبیعی و عوارض موجود و علائم شناخته شده بیماری های درخت زیتون یادداشت و از اندام های دارای علائم و بیمار نمونه برداری گردید. درختان از نظر ماکروسکوپی به دقت بررسی و در صورت وجود علائم غیرطبیعی در اندام های هوایی درخت، علائم مزبور یادداشت و ثبت گردید. با مشاهده علائم پژمردگی و زوال تدریجی درخت ، خاک اطراف ریشه و طوقه را کنار زده و اندام های زیرزمینی هم بررسی شد و همان طور که اشاره شد بافت های بیمار یا مشکوک به بیماری جمع آوری و نمونه برداری گردید. نمونه ها با ذکر مشخصات در کیسه های پلاستیکی جهت بررسی های آزمایشگاهی و جداسازی عوامل بیماری زا به آزمایشگاه منتقل گردیدند. علائم و نمونه های بیماری های احتمالی ویروسی نیز توسط محققان به بخش تحقیقات ویروس شناسی موسسات تحقیقات آفات و بیماری های گیاهی جمع آوری و در بخش های مزبور مورد بررسی قرار گرفتند.

2- کشت نمونه ها : اندام های آلوده (ریشه، طوقه ، تنه و برگ) پس از شستشو در آب جاری به قطعات کوچک تقسیم و به طور جداگانه توسط هیپوکلریت سدیم 5/0 درصد به مدت 3 دقیقه ضدعفونی سطحی گردید. سپس قطعات ضدعفونی شده در محیط کشت های PDA، زاپک – الکل (CzaPek) و CMA کشت و به مدت 4-3 روز در دمای 25 درجه سانتی ‌گراد نگه داری گردید. پس از ظهور کلنی ها از طریق نوک ریسه یا تک اسپور در روی محیط کشت WA اقدام به خالص سازی گردید. جدایه های خالص سازی شده مجدداً بر روی SEA منتقل و در 4 درجه سانتی گراد برای بررسی های بعد نگه داری گردید.